Главная страница

УСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология


Скачать 433,08 Kb.
НазваниеУСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
Янченко Татьяна Александровна
Дата07.02.2017
Размер433,08 Kb.
ТипАвтореферат



На правах рукописи

Янченко Татьяна Александровна


уСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2011


Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии (ВНИИБТЖ).

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, доцент

Таллер Любовь Аркадьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Аликин Юрий Серафимович,
доктор ветеринарных наук, профессор

Луницын Василий Герасимович
Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии

им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (ВИЭВ)


Защита состоится « 29 » ноября 2011 г. в «____» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.
С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» __________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева


  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Туберкулез крупного рогатого скота занимает особое место среди инфекционной патологии животных. Инфекция длительное время может протекать в латентной форме, не проявляя клинических признаков болезни, не влияя на продуктивность и жизнедеятельность животных. Быстро распространяясь среди поголовья животных, туберкулез искореняется с большим трудом.

В неблагополучных хозяйствах туберкулез крупного рогатого скота наносит значительный экономический ущерб владельцам животных и представляет большую опасность в заражении людей, организация мероприятий по борьбе с этим заболеванием была и остается актуальной проблемой.

Против туберкулеза животных пока не разработано эффективных средств специфической профилактики и лечения. Поэтому, основным звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий является своевременная и качественная диагностика.

Одним из основных диагностических подходов является обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в исследуемом диагностическом материале (бронхиальные смывы, мокрота, моча, кровь, лимфатические узлы, кусочки паренхиматозных органов и др.).

Наиболее эффективным методом выявления микобактерий на сегодняшний день является культуральный посев на питательные среды. Также в последнее время широкое развитие получил современный молекулярно-генетический метод – полимеразная цепная реакция (А.С. Донченко и др., 1994, 2004;
В.И. Голышевская, 1995; Л.А. Таллер и др., 1995; В.Г. Ощепков и др., 2001, 2009; Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов и др., 2002; Т.М. Shinnik, 1996).

Выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала, в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя, связано с определенными трудностями – это медленный рост на искусственных питательных средах, способность к полиморфизму и длительной персистенции возбудителя в измененной форме (В.С. Федосеев, И.Н. Рубцова, А.Н. Байгазанов, 1988; О.А. Иртуганова, 2006).

В связи с тем, что туберкулез в настоящее время остается огромной проблемой человечества, усовершенствование лабораторной диагностики, направленное на повышение чувствительности известных традиционных методов и сокращение сроков исследования, за счет модификации существующих и разработки новых способов диагностики этого заболевания, является актуальной задачей.

Цель и задачи. Целью настоящей работы было усовершенствовать методы выделения и идентификации микобактерий туберкулеза из биоматериала, взятого от животных.


Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

        1. Разработать питательную среду, позволяющую ускорить выделение и повысить высеваемость микобактерий туберкулеза из биоматериала от крупного рогатого скота.

  1. Разработать метод ускоренного выявления микобактерий туберкулеза на основе комбинированного применения культурального метода и полимеразной цепной реакции.

Научная новизна.

Разработана плотная питательная среда, содержащая фитопрепарат – 10%-ный водный экстракт полыни – для ускоренной изоляции типичных и измененных микобактерий туберкулеза, повышающая высеваемость микобактерий из биоматериала животных на 30%. Получен патент
№ 2382076 «Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза» от 20 февраля 2010 г.

Впервые разработан комбинированный культурально-генетический метод (КГМ), основанный на исследовании «слепых» смывов с поверхности питательных сред в ранние сроки культивирования методом полимеразной цепной реакции. Предлагаемый метод позволяет дополнительно выявлять труднорастущие и некультивируемые формы микобактерий, при этом значительно сокращая сроки исследования до 3-5 суток.

Практическая значимость и внедрение результатов исследований.

Повышение высеваемости микобактерий, выделенных из биоматериала от животных и сокращение сроков исследования, позволяет оперативно организовывать противотуберкулезные мероприятия в неблагополучных хозяйствах, а в случае исключения туберкулеза - предотвращать необоснованный убой здоровых животных.

Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций:

«Комплекс ускоренной дифференциальной диагностики туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота в благополучных хозяйствах», утвержденные секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области, протокол № 9 от 15.11.08;

«Методы ускоренного выявления типичных и измененных (L-форм) микобактерий туберкулеза», утвержденные секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области, протокол № 5 от 30.09.10;

Также материалы исследований использованы при проведении научно-исследовательской работы в ГНУ ВНИИБТЖ и учебном процессе Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ.

Апробация. Материалы исследований доложены на заседаниях ученого совета ВНИИБТЖ г. Омск (2006-2010г.), координационных совещаниях ВИЭВ
г. Москва (2006-2010г.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Института ветеринарной медицины ОмГАУ (2008, 2010г.), на заседаниях совета молодых ученых ВНИИБТЖ (2006-2011 г.), на межрегиональных научно-практических конференциях ВНИИБТЖ (2007-2010г.), на международной научной конференции молодых ученых,
г. Новосибирск (2010г.). Основные положения диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (2011г.).

Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 15 научных статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Ветеринария и кормление», «Достижения науки и техники АПК»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 13 рисунками. Библиографический список включает 223 источника, в том числе 31 – иностранных автора.

Автор выражает искреннюю благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертационной работы и оказание научно-методической помощи кандидатам ветеринарных наук А.Д. Панкратовой и Е.Ю. Секину, а также сотрудникам лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Усовершенствованная плотная питательная среда, содержащая фитопрепарат, для ускоренного выявления микобактерий туберкулеза.

  2. Разработанный метод диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с использованием полимеразной цепной реакции.


2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных (ГНУ ВНИИБТЖ) в лаборатории клеточной биотехнологии (2006-2008), в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом (2009-2010), часть исследований выполняли в лаборатории диагностических исследований и биотехнологии (2006-2009) в соответствии планом научно-исследовательских работ по заданию 08.01.04 «Создать систему иммунной защиты крупного рогатого скота от туберкулеза с применением молекулярных вакцин. Выявить молекулярно-генетические аспекты паразито-хозяинных отношений при туберкулезе животных и обосновать ускоренную диагностику с учетом изменчивости свойств возбудителя».

Биологический материал для исследования отбирали в хозяйствах Омской и Новосибирской областей с различным эпизоотическим состоянием по туберкулезу животных, а также на мясокомбинате МПЗ «Компур» г. Омска и мясокомбинате г. Калачинска в период с 2006 по 2010 гг.

Для проведения лабораторных исследований был отобран биологический материал: лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов от 311 голов крупного рогатого скота, положительно реагировавших на ППД-туберкулин. Для эксперимента на лабораторных животных использовали 25 морских свинок.

Кроме этого, для исследования использованы коллекционные, официально зарегистрированные штаммы культур: M.bovis шт.8, M.avium шт.9 (получены в 1986 году в Государственном научно-контрольном институте), а также M.bovis шт.14, M.intracellulare (получены в 1986 году в лаборатории специфической профилактики туберкулеза ВНИИБТЖ).

Бактериологические исследования, включающие бактериоскопический метод, культуральный посев, биопробу на лабораторных животных проводили в соответствии с нормативно-технической документацией.

Предпосевную обработку биологического материала от лабораторных животных и крупного рогатого скота проводили по методу Гона в модификации Левенштейна-Сумиоши.

Для сокращения сроков выделения микобактерий из биологического материала от животных нами сконструированы 4 варианта питательных сред с использованием биологически активных добавок растительного происхождения.

За основу взяты стандартные плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л, как наиболее часто используемые в бактериологической диагностике туберкулеза.

В качестве ростостимулирующих добавок изучали 10%-ный водный экстракт полыни и 10%-ный водный экстракт «Лив-52».

Бактериоскопические исследования проводили по методу Циль-Нильсена с оценкой результатов в визуализированной системе с фотодокументированием Axiostar plus Carl Zeiss. Результаты обработаны в программе Axiovision Rel 4.7. Всего исследовано 1200 мазков.

Видовую идентификацию выделенных культур проводили общепринятыми культурально-биохимическими методами (Наставление по диагностике туберкулеза, 2002).

В необходимых случаях, проводили биологическую пробу на морских свинках (всего использовано 98 голов).

Нами проведены исследования по разработке культурально-генетического метода, основанного на сочетании культурального посева на модифицированные питательные среды и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-системы «МТБ-КОМ» производства НИИ Эпидемиологии, г. Москва.

Материалом для исследования в ПЦР служили смывы с поверхности питательных сред на 3, 5, 10, 17 сутки культивирования, без видимого роста бактериальных культур. Всего исследовано 327 смывов.

Выявление ДНК Mycobacterium tuberculosis complex проводили методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. ПЦР-амплификацию проводили на приборе «Ampli-4» производства «ДНК-Технология», Россия.

Экспериментальные данные обработаны методами математической статистики с использованием критериев Стьюдента, средние значения (M±m), достоверность разницы опытных и контрольных показателей (Р) определены с помощью программы Microsoft Excel.

Подробно схемы опытов, методы и методики исследований изложены в соответствующих разделах диссертации.
2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1 Изучение влияния фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста музейных и полевых культур микобактерий


Для определения оптимальной концентрации фитопрепаратов, позволяющей повысить ростовые качества плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена, приготовлены следующие варианты:

Вариант-1 – Левенштейна-Йенсена с добавлением 10%-ного водного экстракта полыни;

Вариант-2 – Левенштейна-Йенсена с добавлением 10%-ного водного экстракта «Лив 52»;

Контроль – Левенштейна-Йенсена в обычной прописи.

Фитопрепараты вносили в дозах 0,1; 0,2; 0,3 мл в пробирки с 5 мл готовых сред.

Для изучения влияния фитопрепаратов на ростовые свойства микобактерий использовали музейную культуру M.bovis шт.14 (ВНИИБТЖ).

Наблюдения за посевами проводили ежедневно до появления видимого роста, а затем каждые 7 суток. Показатели скорости появления первичного роста культуры M.bovis шт.14 на испытуемых и контрольной средах представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Влияние различных доз фитопрепаратов на рост M.bovis штамм 14 на среде Левенштейна-Йенсена

Питательные среды

Доза фитопрепарата, мл

Сроки появления первичного роста на средах, сутки (M±m)

Вариант-1

0,1

0,2

0,3

8,40±0,11*

6,30±0,10*

8,85±0,22*

Вариант-2

0,1

0,2

0,3

8,85±0,08*

7,40±0,11*

9,7±0,15*

Контроль

-

11,45±0,19

*Р < 0,05-0,001 – по отношению к контролю.
Лучшие результаты отмечались при добавлении фитопрепарата в дозе
0,2 мл. Так, при посеве культуры на Вариант-1 первичный рост наблюдался на 6,30±0,10 сутки, что в 1,8 раза быстрее, чем в контроле (11,45±0,19). При добавлении этого фитопрепарата в дозах 0,1 и 0,3 мл появление колоний отмечали на 8,40±0,11 и 8,85±0,22 сутки соответственно.

При посеве культуры на Вариант-2 с добавлением фитопрепарата в дозе 0,2 мл появление первичного роста наблюдалось на 7,40±0,11 сутки, что в 1,5 раза быстрее относительно контроля (11,45±0,19 сутки), а в дозах 0,1 и 0,3 мл – только на 8,85±0,08-9,7±0,15 сутки соответственно.

При сравнении полученных результатов, видно, что исследуемые фитопрепараты, добавленные к среде Левенштейна-Йенсена (Вариант-1 и Вариант-2) в дозе 0,2 мл оказывают наиболее эффективное влияние на рост музейной культуры M.bovis шт.14, поэтому в дальнейших исследованиях применение фитопрепаратов проводилось именно в этой дозе.

Для изучения влияние указанных фитопрепаратов на стимуляцию роста музейных культур патогенных и атипичных микобактерий, приготовлено 4 варианта сред:

Вариант-1 – Левенштейна-Йенсена с добавлением 10%-ного водного экстракта полыни;

Вариант-2 – Левенштейна-Йенсена с добавлением 10%-ного водного экстракта «Лив 52»;

Вариант-3 – Фаст-3Л + 10%-ный водный экстракт полыни;

Вариант-4 – Фаст-3Л + 10%-ный водный экстракт «Лив 52»;

Контроль – Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л в оригинальной прописи.

Результаты опыта представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Влияние фитопрепаратов на рост патогенных и атипичных микобактерий

Культуры

Сроки появления первичного роста культур на питательных средах, сутки (M±m)

Левенштейна-Йенсена

Фаст-3Л

контроль

вариант-1

вариант-2

контроль

вариант-3

вариант-4

M. bovis шт.14

11,05±0,27

6,10±0,23*

6,4±0,2*

14,2±0,2

6,2±0,24*

7,2±0,17*

M. bovis шт.8

10,95±0,19

6,5±0,12*

7,45±0,11*

13,3±0,15

6,5±0,19*

7,0±0,18*

M. avium шт.9

8,10±0,2

6,65±0,15*

7,1±0,25*

11,15±0,2

7,2±0,17*

7,35±0,15*

M.intracellulare

9,4±0,112

4,45±0,11*

4,6±0,11*

11,25±0,18

5,42±0,19*

5,89±0,2*

*Р < 0,05-0,001 – по отношению к контролю.
Из полученных данных видно, что первичный рост M.bovis шт.14 на всех испытуемых вариантах наблюдался в среднем на 6-7 сутки, что в 2 раза раньше, чем в контролях (11-14 сутки).

При посеве на эти же среды культуры музейного штамма M.bovis шт.8, наблюдались аналогичные результаты.

Показатели скорости роста культуры M. avium шт.9 на всех испытуемых средах также демонстрировали одинаковые значения с незначительным преимуществом Варианта-1. Появление колоний на испытуемых вариантах регистрировали на 2-3 суток раньше, чем на контрольных средах Левенштейна-Йенсена (8,1±0,2) и Фаст-3Л (11,15±0,2). Однако они отличались по характеру роста, на контрольных пробирках в виде единичных округлых колоний, а на средах с фитопрепаратами в виде тонкого сплошного налета.

Первичный рост колоний M.intracellulare на модифицированных средах отмечали в среднем на 4-6 сутки, что на 5-6 суток быстрее, чем в Контроле (на среде Левенштейна-Йенсена – 9,4±0,11 сутки и на Фаст-3Л – 11,25±0,18 сутки).

Изучение влияния растительных добавок на скорость и интенсивность роста эпизоотических культур проводили на культурах M.bovis, выделенных из биоматериала от крупного рогатого скота и находящихся в рабочей коллекции. Так как культуры были выделены из биоматериала на среде Фаст-3Л, поэтому в опыте использовали эту среду. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Характеристика роста полевых (эпизоотических) культур M. bovis на различных вариантах среды Фаст-3Л

Культуры

Скорость и интенсивность роста, (M±m)

контроль

вариант-3

вариант-4

сутки

баллы

сутки

баллы

сутки

баллы

1

13,5±0,17*

1,4±0,16

4,5±0,17*

2,3±0,15*

4,8±0,13*

2,1±0,23*

2

28,4±0,16*

1,6±0,16

20,0±0,17*

3,2±0,25*

21,4±0,16*

4,3±0,21*

3

роста нет

-

20,4±0,16

1,4±0,16

20,7±0,15

4,4±0,16

4

роста нет

-

9,2±0,33

1,5±0,17

20,3±0,15

3,4±0,22

5

роста нет

-

10,5±0,17

3,4±0,16

20,5±0,17

4,5±0,17

*Р < 0,05-0,001 – по отношению к контролю.
При наблюдении за посевами, выяснилось, что на контрольных пробирках скудный рост (1,4-1,6 балла) отмечался в двух случаях из пяти на 13,5±0,17 и 28,4±0,16 сутки, тогда как на опытных пробирках рост отмечался во всех случаях. Среди них одна культура была выделена в ранние сроки – на 4,5±0,17 на Варианте-3 и на 4,8±0,13 сутки на Варианте-4, остальные в среднем на 10-21 сутки, интенсивность роста колоний на Варианте-3 в среднем составила 2,4 балла, а на Варианте-4 – 3,7 балла.

Таким образом, наблюдения показали, что внесение биологически активных добавок растительного происхождения в плотные питательные среды, даже такие многокомпонентные как Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л, способствует сокращению сроков появления первичного роста микобактерий. Особенно это заметно при посеве патогенных, обычно медленнорастущих микобактерий.

2.2.2 Изучение влияния фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста микобактерий туберкулеза из биологического материала от лабораторных животных


Для сравнительной оценки диагностических качеств испытуемых вариантов питательных сред исследован материал от 25 экспериментально зараженных морских свинок убитых в разные сроки наблюдения – на 3, 7, 14, 21 и 28 сутки.

При проведении патологоанатомического исследования в первые три срока (3, 7, 14 сутки) изменений туберкулезного характера в органах опытных животных не обнаружено. На 21 и 28 сутки в печени, легких и селезенке регистрировали характерные туберкулезные изменения (таблица 4).

В результате проведенных бактериологических исследований было установлено, что из биоматериала от Ι группы животных, убитых на третьи сутки наблюдения культур микобактерий не выделено.

Из биоматериала от ΙΙ группы, на Варианте-1 и Варианте-2 выделены культуры микобактерий в среднем на 25-26 сутки, что на 2-3 суток раньше, чем в Контроле (27-29 сутки). На среде Фаст-3Л во всех случаях роста не отмечалось.

Таблица 4 – Влияние фитопрепаратов на рост микобактерий туберкулеза, выделенных из биологического материала от лабораторных животных


Группа морских свинок (срок убоя)

Сроки появления первичного роста культур на модифицированных питательных средах, сутки (M±m)

Левенштейна-Йенсена

Фаст-3Л

контроль

вариант-1

вариант-2

контроль

вариант-3

вариант-4

Ι группа (3 сутки)













ΙΙ группа (7сутки)

28,20±0,2

25,20±0,2*

26,2±0,2*







ΙΙΙ группа (14 сутки)

26,10±0,2

20,75±0,2*

22,05±0,2*

25,05±0,2

24,30±0,2*

24,05±0,2*

ΙV группа (21 сутки)

19,40±0,1

15,9±0,2*

16,55±0,2*

24,15±0,2

21,9±0,2*

22,2±0,2*

V группа (28 сутки)

19,15±0,2

15,65±0,2*

16,85±0,2*

23,45±0,1

21,2±0,2*

21,6±0,2*

*Р < 0,05-0,001 – по отношению к контролю.
На 14 сутки с момента заражения из биоматериала от ΙΙΙ группы морских свинок микобактерии выделены на всех испытуемых вариантах, причем на модифицированных средах Левенштейна-Йенсена сроки появления первичного роста отмечаются в среднем на 4-5 суток раньше сред на основе Фаст-3Л.

На 21-28 сутки наблюдения культуры на всех вариантах выделены в среднем на 2-4 суток раньше, чем в Контроле, также отмечалось преимущество модифицированной среды Левенштейна-Йенсена в сравнении со средой Фаст-3Л с этими же добавками. При сравнении испытуемых вариантов между собой, наиболее ранние сроки появления роста колоний наблюдались на Варианте-1.

2.2.3 Изучение влияния фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста микобактерий туберкулеза из биологического материала

от крупного рогатого скота


Изучение эффективности экспериментальных сред при выделении микобактерий от крупного рогатого скота проведено на биоматериале от 124 голов из хозяйств с разной эпизоотической ситуацией по туберкулезу. В том числе 108 из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Исилькульского, Горьковского, Оконешниковского районов Омской области, из них 79 имели туберкулезные поражения и 29 – без видимых поражений, характерных для этой инфекции. Также исследован биоматериал от 16 голов крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств Челябинской области.

При исследовании биоматериала от крупного рогатого скота из неблагополучных хозяйств сокращение сроков роста отмечалось на всех испытуемых вариантах питательных сред, однако лучшие результаты получены на Варианте-1 и Варианте-2, при этом рост культур M. bovis регистрировали на
7-8 суток раньше относительно Контроля (табл. 5).

При посеве биоматериала от крупного рогатого скота из благополучных хозяйств выделены культуры только «атипичных» микобактерий, на испытуемых средах с биодобавками первичный рост отмечался на 2-3 суток раньше по сравнению с Контролем (табл. 6).

Проведенные исследования показали положительный эффект использования биостимуляторов растительного происхождения для ускоренного выявления как патогенных, так и «атипичных» микобактерий, среди которых

Таблица 5 – Выделение микобактерий туберкулеза на различных вариантах питательных сред из биоматериала от крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств

Характеристика исследуемого материала

Кол-во проб

Выделено культур (шт.)

Скорость роста на средах, сутки (M±m)

Левенштейна-Йенсена

Фаст-3Л

контроль

вариант-1

вариант-2

контроль

вариант-3

вариант-4

с видимыми туб. поражениями

79

52

26,4±0,40

18,4±0,16*

19,1±0,23*

29,5±0,11

24,1±0,32*

22,5±0,19*

без видимых поражений

29

12

29,1±0,23

25,9±0,28*

26,5±0,17*

22,6±1,63

18,6±1,63*

19,4±0,22*

*Р < 0,05-0,001 – по отношению к контролю.
Таблица 6 – Результаты сравнительного испытания различных вариантов питательных сред при выделении «атипичных» микобактерий из биоматериала от крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств

Название

хозяйств

Количество исследо-ванных проб

Выделено культур атипичных микобактерий

Скорость роста на средах, сутки

Левенштейна-Йенсена

Фаст-3Л

контроль

вариант-1

вариант-2

контроль

вариант-3

вариант-4

ОПХ «Троицкое»

4

16

8,5±0,15

5,5±0,15*

6,5±0,15*

7,45±0,21

5,35±0,11*

5,45±0,11*

ТОО «Карсинское»

2

9

8,75±0,24

5,30±0,19*

6,85±0,23*

6,30±0,23

4,5±0,15*

4,5±0,19*

ООО «Кособродское»

3

12

4,35±0,19

2,3±0,11*

2,3±0,11*

5,85±0,08

3,80±0,17*

3,94±0,27*

СХП «Белозерское»

5

21

7,40±0,17

4,35±0,15*

4,25±0,18*

5,60±0,11

3,55±0,15*

3,60±0,18*

СХП «Заря»

2

7

4,60±0,11

3,65±0,19*

3,75±0,18*

4,7±0,11

4,35±0,13*

2,4±0,11*

Всего

16

65

6,72±0,17

4,2±0,16*

4,73±0,17*

6,0±0,15

4,31±0,14*

3,98±0,17*

*Р < 0,05-0,001 – по отношению к контролю.

наиболее эффективно применение 10%-ного водного экстракта полыни в сочетании со средой Левенштейна-Йенсена (Вариант-1).

Наряду со сроками первичного роста культур изучали их высеваемость. Объектом исследования служил биоматериал от 57 голов крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств. Анализ высеваемости культур на модифицированных питательных средах в сравнении с контрольными представлен на рисунке 1.


Рисунок 1 – Высеваемость эпизоотических культур M.bovis на различных вариантах питательных сред
Полученные результаты показали, что при посеве биоматериала от крупного рогатого скота с туберкулезными поражениями наиболее эффективной оказалась среда Вариант-1. Высеваемость культур на ней составила 78,5%, это на 21,4% больше, чем в Контроле и на 28,5% больше, чем на Варианте-2. Первичный рост на Варианте-1также отмечался на 4 суток раньше.

При исследовании биоматериала без визуально регистрируемых туберкулезных поражений высеваемость культур на Варианте-1 составила 46,2%, что на 30% больше, чем в Контроле и на 11,4% больше чем на Варианте-2. На средах Вариант-3 и Вариант-4 показатели высеваемости ниже. Из биоматериала с туберкулезными поражениями культуры выделены в 35,7% и 14,2% случаев соответственно, а из биоматериала без туберкулезных поражений в 20,9% и 27,9% случаев.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили данные полученные нами ранее о том, что растительные добавки – 10%-ные водные экстракты полыни и «Лив-52» – оказывают стимулирующее влияние на рост микобактерий туберкулеза, что является особенно важным при выделении их из биологического материала.

Питательная среда, разработанная на основе коммерческой плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена с добавлением 10%-ного водного экстракта полыни, проста в изготовлении и экономична.

2.2.4 Испытание модифицированных питательных сред в сочетании с полимеразной цепной реакцией для индикации и идентификации микобактерий туберкулеза


С целью разработки культурально-генетического метода (КГМ) проведено испытание модифицированных питательных сред в сочетании с полимеразной цепной реакцией для индикации микобактерий туберкулеза.

Нами разработана и испытана схема постановки культурально-генетического метода, состоящая из следующих основных этапов:

  1. Посев предварительно обработанного биоматериала на модифицированные питательные среды (5-10 пробирок) с инкубированием в термостате при температуре 37-38°С.

  2. Приготовление «слепых» смывов (образцов) с поверхности питательных сред.

  3. Исследование образцов методом полимеразной цепной реакции первоначально с использованием комплексной тест-системы «МТБ-КОМ» производства ФГУН ЦНИИ «Эпидемиологии» для выявления патогенных микобактерий (Mycobacterium tuberculosis complex).

При необходимости видовой дифференциации используют тест-системы с моновидовыми праймерами: M.tuberculosis, M.bovis.

Для исследования отобран биоматериал с туберкулезными поражениями от 9 голов крупного рогатого скота из хозяйств неблагополучных по туберкулезу (табл. 7).
Таблица 7 – Результаты сравнительного изучения методов выявления микобактерий


Номер пробы

Микроскопия мазков-отпечатков

Биопроба на лабораторных животных

Выявление микобактерий методом бак. посева

Выявление ДНК микобактерий методом ПЦР

срок исследования, сутки

1-2

40-60

20-40

5

10

17

1

+

+

+

+

+

+

2



+



+

+

+

3



+





+

+

4



+

+

+

+

+

5



+



+

+

+

6



+

+

+

+

+

7

+

+

+

+

+

+

8



+

+

+

+

+

9

+

+

+

+

+

+

Итого, %

33,3

100

66,6

88,8

100

100
Примечание: (+) – положительный результат исследования

(–) – отрицательный результат исследования
На 5, 10 и 17 сутки культивирования, при отсутствии видимого роста культур, готовили смывы с поверхности одной пробирки каждой экспертизы и исследовали методом ПЦР. В 88,8%-100% случаев исследуемых проб отмечалась положительная реакция, что говорит о наличии в них Mycobacterium tuberculosis complex.

При микроскопии мазков-отпечатков из этих проб, микобактерии были выявлены в 33,3% случаев. Чаще всего наблюдались плохо прокрашенные зерна; красные, тонкие, изогнутые палочки единичные и скоплениями в виде жгутов и кос.

Видимый рост культур М.bovis наблюдался только в 6 (66,6%) пробирках питательных сред на 20-40 сутки, морские свинки в 100% случаев пали на 40-60 сутки.

В последующем, мы провели опыты, направленные на сокращение сроков исследования.

Был отобран биоматериал от 40 голов крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств, в том числе 12 проб – с характерными туберкулезными поражениями и 28 – без поражений.

Для исследования КГМ с поверхности питательных сред
(Левенштейна-Йенсена, Вариант-1 и Вариант-2) на 3 сутки культивирования, до появления видимого роста, было приготовлено 120 смывов и исследовано в ПЦР. В качестве дополнительного контрольного образца использовали суспензию из культуры коллекционного патогенного штамма М. bovis 14 в разведении 1:10-6. Результаты представлены в таблице 8.

Данные таблицы 8 подтверждают возможность обнаружения микробного агента (патогена) в исследуемом биоматериале культурально-генетическим методом уже на 3 сутки.

При исследовании КГМ 36 смывов (образцов) из 12 проб биоматериала с характерными туберкулезными поражениями положительная реакция отмечалась в 36 образцах (100,0%).

Культуральным методом микобактерии туберкулеза были выделены из 8 проб биоматериала (66,6%) только на 20-40 сутки.

Биологическим методом туберкулез был подтвержден в 100% случаев, но лишь на 40-60 сутки.

При исследовании КГМ 84 смывов (образцов) из 28 проб биоматериала без туберкулезных поражений во всех пробах получен отрицательный результат.

При культуральном исследовании рост M.bovis не отмечался. Биологическая проба на морских свинках также отрицательная в 100% случаев.

При исследовании контрольной культуры M.bovis шт.14 культурально-генетическим методом и традиционными в 100% случаев получен положительный результат.

Из всех исследованных в ПЦР смывов были приготовлены мазки и окрашены по Цилю–Нильсену, при микроскопии обнаружены как бактериальные формы в виде типичных красных палочек, так и измененные – в виде шаровидных клеток, зернистых элементов, нитевидных структур, обладающих пониженной жизнеспособностью.

Таблица 8 – Результаты исследования биоматериала от крупного рогатого скота культурально-генетическим методом (посевы+ПЦР) в сопоставлении с традиционным бактериологическим методом

Характеристика исследованного биоматериала

Кол-во исслед. проб биоматериала

Кол-во исслед. в ПЦР образцов

Результаты полученные:

комбинированным методом

(посевы+ПЦР) 3 сутки

традиционным бактериологическим методом

положит.*

отрицат.

культуральное исследование

20-40 сутки

биологическая проба

40-60 сутки

кол-во

%

кол-во

%

положит.*

отрицат.

положит.*

отрицат.

Биоматериал с характерными туберкулезными поражениями

12

36

36

100,0





8

66,6

4

33,4

12

100,0





Биоматериал без характерных туберкулезных поражений

28

84





84

100,0





28

100,0





28

100,0

Культура M.bovis шт.14

(контроль)

1

3

3

100,0





1

100,0





1

100,0





Примечание: (*) – выявлены микобактерии туберкулеза.
Таблица 9 – Результаты сравнительного исследования биоматериала от крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств различными методами

Методы исследования

Количество проб

Сроки исследования, сутки

Результаты исследования, выделено культур

культурально-генетический

27

3

-

27

5

-

культуральный

27

20-40

7*

биологический

27

40-60

-

Примечание: * – выделены «атипичные» микобактерии

Данные таблицы 9 свидетельствуют, что культурально-генетическим методом положительных проб не выявлено. Методом традиционного культурального посева выделены только «атипичные» микобактерии, принадлежащие к III-IV группе по классификации Раньона. Биологическая проба на лабораторных животных во всех случаях дала отрицательный результат.

Таким образом, разработанный нами культурально-генетический метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет сократить сроки диагностических исследований на туберкулез в 6-20 раз в сравнении с традиционными методами, поэтому его целесообразно использовать в качестве дополнительного экспресс-метода для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
3. ВЫВОДЫ


  1. Установлено, что на новой питательной среде для культивирования микобактерий туберкулеза, созданной на основе яичной среды Левенштейна-Йенсена с добавлением 10%-ного водного экстракта полыни, высеваемость микобактерий из биологического материала на 30,0 % выше по сравнению со стандартной средой без фитопрепарата.

  2. Доказано стимулирующее влияние 10%-ного водного экстракта полыни, добавленного в дозе 0,2-0,3 мл к 5 мл готовой питательной среды Левенштейна-Йенсена, на интенсивность накопление бактериальной массы и сокращение сроков роста культур микобактерий на 3-5 суток.

  3. Разработан комбинированный культурально-генетический метод (КГМ) для ускоренной индикации и идентификации микобактерий туберкулеза, который дополнительно выявляет труднорастущие и некультивируемые формы микобактерий, сокращает сроки исследования и повышает достоверность диагностики на 33,4% по сравнению с традиционными бактериологическими методами.

  4. Исследование смывов с поверхности питательных сред методом полимеразной цепной реакции с использованием тест-системы «МТБ-КОМ» производства ФГУН ЦНИИ «Эпидемиологии» г. Москва позволяет выявить ДНК Mycobacterium tuberculosis complex на 3-5-е сутки и дифференцировать патогенные (M.bovis, M.tuberculosis и др.) и «атипичные» микобактерии (II, III, IV групп по Раньону) в 100% случаев.

  5. Использование в диагностическом комплексе дополнительно комбинированного культурально-генетического метода позволяет в 94% случаев объективно оценить инфицированность животных и эпизоотический статус ферм по туберкулезу.


4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

  1. В лабораторной диагностике рекомендуем использовать «Питательную среду для культивирования микобактерий туберкулеза» для сокращения сроков культивирования и повышения выделяемости культур микобактерий из биоматериала.

  2. Комбинированный культурально-генетический метод рекомендуем использовать в качестве экспресс-метода для наиболее эффективного обнаружения микобактерий в исследуемых образцах дополнительно к традиционным приемам микробиологической диагностики.

  3. Основные положения диссертации рекомендуются к использованию в учебном процессе учреждений микробиологического и ветеринарного профиля.

5. Список работ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Абдыраманова, Т.Д. Влияние фитодобавок на рост патогенных и атипичных микобактерий на питательной среде / Т.Д. Абдыраманова,
    Л.В. Галатова, Л.А. Таллер, Т.А. Вассимирская, А.С. Шевцов, В.Г. Ощепков // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2008. – № 3. – С.103-105.


  2. Таллер, Л.А. Разработка методологических подходов использования полимеразной цепной реакции при диагностике туберкулеза с учетом изменчивости свойств возбудителя / Л.А. Таллер, Е.Ю. Секин,
    Т.А. Вассимирская // Ветеринария и кормление. – 2009. – № 4. – С. 12-14.


  3. Ощепков, В.Г. Дифференциальная диагностика туберкулеза с применением хемилюминесцентного метода / В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, Г.М. Дюсенова, Т.А. Вассимирская, Е.Ю. Секин //Достижения науки и техники АПК. – 2009. – № 12. – С. 41-44.

  4. Патент РФ №2382076 Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза/ В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, А.Д. Панкратова, Т.А. Вассимирская, А.С. Шевцов, заяв. от 28.07.2008 опубл. 20.02.2010, Бюл. №5. – 1 с.

  5. Вассимирская, Т.А. Бактериологическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с учетом изменчивости свойств возбудителя /
    Т.А. Вассимирская // Патология сельскохозяйственных животных и пути ее профилактики: материалы 6-й межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 85-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ. – Омск, 2007. – Вып. 2. – С. 40-44.

  6. Таллер, Л.А. Сравнительная оценка питательных сред с растительными биодобавками для культивирования микобактерий / Л.А. Таллер, В.Г. Ощепков, А.Д. Панкратова, Г.М. Дюсенова, Т.А. Вассимирская, А.С. Шевцов // Патология сельскохозяйственных животных и пути ее профилактики: Материалы 6-й межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 85-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ. – Омск, 2007. – Вып. 2. – С. 168-170.

  7. Вассимирская, Т.А. Использование биологически активных добавок в бактериологической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота /
    Т.А. Вассимирская, В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, А.Д. Панкратова // Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала: материалы 7-й межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 180-летию аграрной науки Сибири. – Омск, 2008. – С. 75-78.

  8. Ощепков, В.Г. Состояние и перспективы бактериологической диагностики туберкулеза / В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, Т.А. Вассимирская,
    Е.Ю. Секин, А.С. Шевцов // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней животных и птиц: сб. науч. тр. ведущих ученых России, СНГ и др. стран. – Екатеринбург, 2008. – Вып. 2. – С. 382-386.

  9. Ощепков, В.Г. Изменчивость свойств патогенных микобактерий и ее значение в бактериологической диагностике туберкулеза / В.Г. Ощепков,
    Л.А. Таллер, Т.А. Вассимирская, Е.Ю. Секин // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: материалы Международ. науч.-практ. конф., посвящ. 125-летию ветеринарии Курской области. – Курск, 2008. – С. 280-283.

  10. Ощепков, В.Г. Экспресс-метод индикации возбудителя туберкулеза / В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, Т.А. Вассимирская, Е.Ю. Секин // Материалы международ. конф., посвящ. 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. – Самара, 2009. – С. 317-320.

  11. Таллер Л.А. Ускоренная индикация и идентификация микобактерий туберкулезного комплекса методом полимеразной цепной реакции / Л.А. Таллер, Т.А. Вассимирская, В.Г. Ощепков, Е.Ю. Секин // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций: материалы науч.-практ. конф., посвящ. памяти проф. И.А. Косилова. – Омск, 2009. – С. 162-165.

  12. Боганец Н.С. Оптимизация дифференциальной диагностики туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота / Н.С. Боганец, Л.А. Таллер, Г.М. Дюсенова, Н.А. Свириденко, Л.Т. Аппельганц, Т.А. Вассимирская,
    Л.М. Каримова // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций: материалы науч.-практ. конф., посвящ. памяти проф. И.А. Косилова. – Омск, 2009. – С.102-108.

  13. Ощепков, В.Г. Ускоренная диагностика туберкулеза животных /
    В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, Е.Ю. Секин, Т.А. Вассимирская, А.Д. Слепченко // Межведомственный тематический сборник «Ветеринарная медицина». – 2010. –
    С. 26-28.

  14. Вассимирская, Т.А. Повышение эффективности диагностики туберкулеза животных при сочетании ПЦР – анализа с культуральным посевом / Т.А. Вассимирская, Л.А. Таллер // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: материалы IV Международ. науч. конф. молодых ученых. – Новосибирск, 2010. – С. 31-34.

  15. Ощепков, В.Г. О длительности и повторности проявления неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота /
    В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, Г.М. Дюсенова, Т.А. Вассимирская, А.Д. Слепченко // Актуальные проблемы инновационного развития ветеринарной науки и практики: материалы Международ. науч.-практ. конф., посвящ. 105-летию КазНИВИ. – Алматы, 2010. – С. 274-279.

  16. Вассимирская, Т.А. Применение полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза в сочетании с культуральным методом /
    Т.А. Вассимирская, Л.А. Таллер, Е.Ю. Секин // Актуальные проблемы инфекционных и инвазионных патологий животных: материалы Международ. науч.-практ. конф., посвящ. памяти А.В. Копырина. – Омск, 2010. – С. 122-126.