Главная страница

Механизм развития инфекции, вызываемой бациллой турингиензис и влияние бактериальных метаболитов на организм личинок большой восковой моли 16.


НазваниеМеханизм развития инфекции, вызываемой бациллой турингиензис и влияние бактериальных метаболитов на организм личинок большой восковой моли 16.
страница1/5
Дзю Елизавета Леонидовна
Дата07.02.2017
Размер0,82 Mb.
ТипАвтореферат
  1   2   3   4   5

На правах рукописи




Дзю Елизавета Леонидовна



Механизм развития инфекции, вызываемой бациллой турингиензис и влияние бактериальных метаболитов на организм личинок большой восковой моли

16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунологией

03.00.09 – энтомология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2007



Работа выполнена в ФГОУ ВПО Новосибирский государственный аграрный университет
Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, заслуженный работник

сельского хозяйства РФ

Незавитин Анатолий Григорьевич


кандидат биологических наук

Литвина Лидия Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Аликин Юрий Серафимович

(ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора),
кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Бахвалов Станислав Андреевич

(ИСиЭЖ СО РАН, г.Новосибирск)

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Алтайский государственный аграрный университет

Защита состоится « » 2007 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, СО Россельхозакадемии, ИЭВСиДВ.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии


Автореферат разослан « » 2007 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. За последние 30-40 лет в нашей стране и за рубежом проведено много исследований, направленных на борьбу с вредителями, болезнями растений и животных. Для этого используют специальные химические и биологические средства.

Применение инсектицидов и фунгицидов довольно часто оказывает отрицательное влияние на качество продукции и экологическое благополучие. Отдельные химические вещества, содержащиеся в инсектицидах, могут накапливаться в сельскохозяйственной продукции и оказывать отрицательное воздействие на здоровье человека [Столбов, 1996; Огурцов, 2003].

Личинки большой восковой моли в отдельные годы причиняют пчеловодству в Западной Сибири большой вред, который выражается в массовой гибели пчелиных семей [Столбов, 1996; Огурцов, 2003; Риб, 2006].

Наиболее перспективным методом в борьбе с личинками большой восковой моли является использование биологических препаратов, обеспечивающих повышение эффективности ведения пчеловодства. Применение биопрепаратов основано на использовании продуктов жизнедеятельности отдельных живых организмов (грибы, микроорганизмы и др.), обладающих антибиотической и бактерицидной способностью.

Отмечено, что многие бактерии обладают высокой патогенностью по отношению к насекомым, а при определенных условиях вызывают острые бактериозы [Штейнхауз, 1952; Бурцева и др., 2001]. Патогенными для насекомых могут быть как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии. Почти все патогенные для насекомых бактерии относятся к родам Bacillales, Clostridiales, Eubacteriales и Pseudomonodales [Штейнхауз, 1952].

Начиная с 50-х годов XX века, бациллы турингиензис (Bacillus thuringiensis) используют для регуляции численности насекомых. Высокой эффективностью при борьбе с личинками большой восковой моли обладает биопрепарат энтобактерин на основе спорово-кристаллического комплекса бациллы турингиензис, созданный во Всесоюзном научно-исследовательском институте защиты растений [Федоринчик, 1974]. Смертность личинок при опрыскивании пчелиных сот 3%-ной свежеприготовленной суспензией этого препарата достигает 90% [Федоринчик, 1974; Столбов, 1996]. Однако, механизм развития инфекции в организме личинок большой восковой моли под действием бациллы турингиензис, а также влияние бактериальных метаболитов на организм личинок до проведения наших исследований не были изучены. Поэтому изучение данной проблемы весьма актуально и может способствовать созданию новых относительно дешевых, экономически выгодных биопрепаратов на основе бациллы турингиензис, а также комплексных препаратов, в состав которых могут входить бактериальные метаболиты, против личинок большой восковой моли.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма развития инфекции, вызываемой бациллой турингиензис и влияния бактериальных метаболитов на организм личинок большой восковой моли.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить механизм развития инфекции в организме личинок большой восковой моли под действием спорокристаллической смеси бациллы турингиензис (штамм Р-2);

2. Выявить влияние бактериальных метаболитов бациллы турингиензис на организм личинок большой восковой моли;

3. Показать механизм действия детоксицирующих и антиоксидантных ферментов, содержащихся в гемолимфе и кишечнике личинок большой восковой моли на их выживаемость.

Научная новизна. Получены новые данные об изменении детоксицирующих ферментов (неспецифических эстераз), активности антиоксидантов – супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-S-трансферазы и концентрации тиолсодержащих веществ при развитии бактериальной инфекции в организме личинок большой восковой моли. Показан механизм развития инфекции в организме личинок большой восковой моли, вызываемой бациллой турингиензис. Впервые изучена характеристика метаболитов бациллы турингиензис (белковые фракции), а также их влияние на организм большой восковой моли. Установлено, что при развитии бактериальной инфекции, вызванной бациллой турингиензис, происходит изменение баланса “оксиданты-антиоксиданты” в гемолимфе и кишечнике личинок большой восковой моли, что сопровождается их высокой смертностью. Показано, что ферментативные и неферментативные компоненты антиоксидантной системы предотвращают разрушение высокореакционных радикалов в гемолимфе, кишечнике личинок большой восковой моли и способствуют их выживаемости.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные в ходе исследований, расширяют научные знания, касающиеся механизма развития инфекции в организме личинок большой восковой моли под действием бациллы турингиензис. Результаты исследований могут служить основой для совершенствования инсектицидных препаратов с использованием новых бактериальных метаболитов, нарушающих баланс “оксиданты-антиоксиданты” у насекомых.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации были представлены на Сибирской зоологической конференции (Новосибирск, сентябрь 2004), на конференции “Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование” (Иркутск, октябрь 2004), на 38th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology (Аляска, август 2005), на II Межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, сентябрь 2005).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ в сборниках научных трудов, в том числе в журнале «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки» и других изданиях.

Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации используются при обучении студентов на факультете ветеринарной медицины ФГО ВПО НГАУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Механизм развития инфекции в организме личинок большой восковой моли под действием спорокристаллической смеси бациллы турингиензис (штамм Р-2);

2. Влияние бактериальных метаболитов бациллы турингиензис на организм личинок большой восковой моли;

3. Механизм действия детоксицирующих и антиоксидантных ферментов, содержащихся в гемолимфе и кишечнике личинок большой восковой моли на их выживаемость.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, результаты собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает 297 источников, из них 207 иностранных авторов.


  1. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ




    1. Материалы и методы


Материалом для исследований служили личинки большой восковой моли 2-6-го возрастов из лабораторной популяции. Пероральное заражение большой восковой моли проводили спорокристаллической суспензией бациллы турингиензис в дозе 1х108 спор/мл на 3,5 грамма среды, которая содержалась в питательной среде.

Метаболиты (белковые фракции) бациллы турингиензис из культуральной жидкости получали после насыщения 70% сульфатом аммония с дальнейшим диализом в 10мМ фосфатном буфере рН 8 с 10мМ NaCl (1 мл суспензии смешивали с 3,5 г среды). Личинки большой восковой моли получали корм, содержащий метаболиты (белковые фракции) бациллы турингиензис (штамм Р-2).

Определение рН стабильности метаболитов (белковые фракции) бациллы турингиензис осуществляли по модифицированному методу Cherif A. [Cherif et al. 2003]. Для измерения рН белковой фракции использовали следующие буферы: 10 мМ цитратный буфер, рН 3; 10 мМ фосфатный буфер, рН 7; 10мМ Трис-НСl буфер, рН 9. Образцы находились сутки в холодильнике, затем их закапывали в Micrococcus lysodeikticus по 100 мкл, результат смотрели через 48 часов по зоне лизиса.

Гемолимфу у личинок большой восковой моли отбирали капилляром через надрезанную ложноножку и помещали в охлаждённые до 6-8 оС пробирки Эппендорф. Для осаждения гемоцитов образцы центрифугировали в течение 5 минут при 1,200 g, после чего супернатант использовали для исследований.

Для приготовления гомогенатов кишечника насекомых препарировали в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,2 с 150 мМ NaCl (ФБ). Извлеченные органы растирали в стеклянном гомогенизаторе с холодным ФБ в соотношении 0,1 г на 1 мл буфера. Затем гомогенаты центрифугировали при 4 °С в течение 15 минут при 10000 g. Полученный супернатант использовали для спектрофотометрического определения активности ферментов, концентрации тиолов.

Активность супероксиддисмутазы определяли при 560 нм по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия супероксид-анионом, образующимся в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой [McCord, Fridovich, 1969]. Активность каталазы определяли при 240 нм по скорости разложения Н2О2 [Wang et al., 2001]. Активность глутатион-S-трансферазы (ГТ) определяли при 340 нм по скорости увеличения концентрации 5-(2,4-динитрофенил)-глутатиона, продукта реакции 1-хлор-2,4-динитробензола и восстановленного глутатиона, катализируемой ГТ [Habig et al., 1974]. Определение активности эстераз в гемолимфе и гомогенатах кишечника проводили по К. Асперену [Asperen, 1962] с незначительными изменениями. Удельную активность ферментов выражали в единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при используемой для измерения длине волны в ходе реакции в расчете на 1 минуту и 1 мг белка при температуре 28°С. Для определения концентрации восстановленных (RSH) и окисленных (RSSR) тиолов использовали спектрофотометрический метод, основанный на окислении RSH 2-нитро 5-тиобензойной кислотой [Khramtsovet al., 1997; Khramtsov et al., 1989]. RSSR предварительно разрушали до RSH 1N соляной кислотой. Концентрацию RSH и RSSR определяли согласно калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой использовали восстановленный глутатион. Концентрацию белка в гомогенатах кишечника определяли по методу Бредфорда [Bradford, 1986]. Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин.

Полученные данные обрабатывали статистически, рассчитывая среднее арифметическое и его ошибку. Для проверки нормальности распределения данных использовали W критерий Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий определяли по t-критерию Стъюдента [Доспехов, 1985].
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Механизм развития инфекции, вызываемой бациллой турингиензис (штамм Р-2), в организме личинок большой восковой моли
При заражении личинок большой восковой моли 2-го возраста кормом, содержащим спорокристаллическую смесь бациллы турингиензис (штамм Р-2), отмечена 100%-я смертность личинок. Наши данные согласуются с результатами ранее проведенных исследований [Obukowitz et al., 1986; Lampel et al., 1994]. У личинок большой восковой моли 4-6-го возрастов, после заражения бациллой турингиензис, в течение 9 дней наблюдалось снижение живой массы в 1,6-16,3 раза по сравнению с контрольными. Зараженные личинки, начиная с 4-го возраста, были малоподвижны и плохо потребляли кормовую массу. Максимальная смертность личинок 4-6-го возрастов отмечалась в первые сутки и составляла 30,0±2,0% (р<0,01). В последующие дни смертность снижалась до 16,1±2,3 (р<0,01) и 0,5±0,5% (р<0,01) соответственно. В контрольных вариантах личинки развивались нормально. Их выживаемость составила 100%.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что бациллы турингиензис (штамм Р-2) обладали ярко выраженной энтомопатогенной активностью к личинкам большой восковой моли 2-го возраста. Наиболее острый период развития бактериальной инфекции проявлялся в первые сутки и сопровождался следующими признаками: вялость, малоподвижность, отказ от корма, изменение окраски, уменьшение живой массы и 100%-я смертность (р<0,01). Высокая смертность личинок обусловлена, по нашему мнению, действием кристаллического белкового -эндотоксина и нарушением целостности и функциональной активности клеточных мембран эпителия кишечника. Учитывая, что до настоящего времени нет работ о роли эстераз при бактериозе насекомых, нами изучено изменение спектра и активности неспецифических эстераз при бактериозе большой восковой моли.

Неспецифические эстеразы в организме у насекомых разрушают образовавшиеся токсические молекулы и способствуют их выведению. Поэтому нами были изучены активность и спектр неспецифических эстераз в гемолимфе и среднем кишечнике у личинок большой восковой моли, зараженных бациллой турингиензис. Оценивая удельную эстеразную активность гемолимфы, обнаружены достоверные различия между интактными и зараженными личинками большой восковой моли только на 5-е сутки (рис.1) после заражения насекомых бациллой турингиензис (штамм Р-2). Через 5 суток после заражения личинок бациллой турингиензис эстеразная активность гемолимфы снижалась в 1,5 раза (р<0,05) по сравнению с контролем. При этом в гемолимфе личинок происходило уменьшение таких изоформ ферментов, как Е3 и E5 (рис.2). Через 24 часа после заражения личинок большой восковой моли спорокристаллической суспензией бациллы турингиензис (штамм Р-2) было выявлено снижение эстеразной активности среднего кишечника в 1,4 раза (р<0,01) (рис.3). В среднем кишечнике у контрольных личинок большой восковой моли было зарегистрировано 7 изоформ в первые сутки (рис. 4А), а у инфицированных особей отмечена исчезновение 1-й изоформы (E5) на первые сутки (см. рис. 4А). На 5-е сутки активность неспецифических эстераз снижалась в кишечнике личинок в 1,7 раза (р<0,05) (см. рис.3). У интактных личинок в среднем кишечнике на 5-е сутки нами зарегистрированы 10 изоформ эстераз, а в опытном варианте – только 7, так как происходила редукция изоформ Е4, Е5, Е6 (см. рис. 4Б). Редукция изоформ и снижение активности неспецифических эстераз в среднем кишечнике личинок большой восковой моли связаны в острой фазе бактериоза насекомых со снижением общего метаболизма и их выживаемостью.




  1   2   3   4   5