Главная страница

Распределение синтазы оксида азота во внутрисердечных нервных ганглиях в норме и при ишемической болезни сердца у человека


НазваниеРаспределение синтазы оксида азота во внутрисердечных нервных ганглиях в норме и при ишемической болезни сердца у человека
страница1/5
Дата02.12.2016
Размер1,06 Mb.
ТипДиссертация
  1   2   3   4   5
1. /Шуклин Андрей Викторович/1-51.doc
4. /Шуклин Андрей Викторович/73-103.doc
Распределение синтазы оксида азота во внутрисердечных нервных ганглиях в норме и при ишемической болезни сердца у человека
Обсуждение результатов

- -

ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава
На правах рукописи

Шуклин Андрей Викторович

Распределение синтазы оксида азота во внутрисердечных нервных ганглиях в норме и при ишемической болезни сердца у человека



03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

з.д.н. РФ, доктор медицинских наук,

профессор Швалев Вадим Николаевич


Москва, 2006

Оглавление


Распределение синтазы оксида азота во внутрисердечных нервных ганглиях в норме и при ишемической болезни сердца у человека 1

Оглавление 2

Список сокращений 4

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Общие сведения об иннервации сердца человека и экспериментальных животных 10

1.1.1. Архитектоника иннервации сердца 10

1.1.2. Топография и характеристика внутрисердечных холинергических ганглиев 12

1.1.3. Нейрохимические маркеры внутрисердечных нейронов 16

1.2. Краткая характеристика синтаз оксида азота 19

1.3. Современные представления о локализации синтаз оксида азота в нервных клетках. Сайт-специфичность влияния NO. 23

1.4. Морфология нейронов, иммунореактивных к NOS, в сердце крысы 27

1.5. Физиологическое значение синтаз оксида азота в вегетативных нейронах, иннервирующих сердце 28

1.5.1. Значение NOS в парасимпатических нервных клетках и терминалях сердца 28

1.5.2. Роль NO для симпатических нервных волокон 32

1.5.3. NO-ергическая модуляция центральных отделов вегетативной нервной системы 33

1.5.4. Потенциальное биомедицинское значение NOS1, экспрессирующейся в интрамуральных ганглиях сердца 33

1.6. Влияние гипертрофии, ишемии и физической нагрузки на экспрессию синтаз оксида азота в сердце 34

Глава 2. Материал и методы 36

2.1. Материал исследования 36

2.2. Методы исследования 38

2.2.1. Реагенты 38

2.2.2. Локализация внутрисердечных ганглиев 39

2.2.3. Окрашивание по Нисслю 40

2.2.4. Определение АХЭ по методу Карновского – Рутс 41

2.2.5. Определение активности NADPH-диафоразы 42

2.2.6. Иммуногистохимическое окрашивание 43

2.2.7. Анализ препаратов, морфометрия и статистическая обработка данных 44

Глава 3. Результаты собственных исследований 46

3.1. Характеристика внутрисердечных ганглиев 46

3.2. NADPH-диафораза во внутрисердечных ганглиях 47

3.3. Иммуногистохимическое определение NOS1 во внутрисердечных ганглиях человека 48

3.4. Влияние ИБС на активность NADPH-d в ганглиях сердца человека 49



Список сокращений


АХ – ацетилхолин

АХЭ – ацетилхолинэстераза, один из маркеров холинергических нейронов

ИБС – ишемическая болезнь сердца

МИФ-клетки – малые интенсивно флюоресцирующие клетки

цАМФ – циклический аденозинмонофосфат, внутриклеточный посредник, «вторичный мессенждер»

цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат, внутриклеточный посредник, «вторичный мессенждер»

ЧСС – частота сердечных сокращений

CGRP (calcitonin-gene-related peptide) – маркер чувствительных нейронов

ChAT – холинацетилтрансфераза, маркер холинергических нейронов

NADPH-d – NADPH-диафораза, гистохимический маркер NOS

NO (nitric oxide) – оксид азота (II)

NOS (nitric oxide synthase) – синтаза оксида азота

NOS1 (nNOS) – нейрональная изоформа NOS

NOS2 (iNOS) – индуцибельная изоформа NOS

NOS3 (eNOS) – эндотелиальная изоформа NOS

NPY (neuropeptide Y) – нейропептид Y

PSD95 (postsynaptic density 95) – постсинаптическое уплотнение 95, связывающее активированную NOS1 и определяющее ее перенос к синаптической мембране

TH (tyrosine hydroxylase) – тирозингидроксилаза

VIP (vasoactive intestinal peptide) – вазоактивный пептид кишечника

Введение


Актуальность проблемы.

Как известно, в настоящее время заболевания сердечно-сосудистой системы являются наиболее часто встречающейся причиной смерти человека. Поэтому любые подходы к их лечению сейчас весьма актуальны. Современная фармакологическая терапия сердечно-сосудистых заболеваний имеет своей мишенью главным образом либо мышечные клетки сердца (блокаторы кальциевых каналов, сердечные гликозиды, β-блокаторы, нитраты), либо гуморальные системы регуляции сосудистого тонуса (ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, нитраты). Перспективным, но недостаточно разработанным направлением в данной области, является воздействие на нервные сплетения сердца – естественную и сложноорганизованную систему активной регуляции его работы и трофики. Одной из предпосылок фармакологического воздействия на нервные клетки является знание их нейрохимической специализации.

Данная работа посвящена изучению фермента, продуцирующего один из важных мессенджеров внутрисердечных нейронов – оксида азота (NO). Благодаря способности проникать через мембрану, оксид азота способен выступать как внутри- (вторичный), так и межклеточный мессенджер, при этом малое время существования свободной молекулы в цитозоле [Ванин, 1998b] ограничивает зону его действия, что обеспечивает высокоспецифичность NO-ергической регуляции, даже в пределах одной клетки [Barouch et al., 2002; Herring et al., 2002; Paton et al., 2002; Mohan et al., 2004]. В качестве вторичного посредника оксид азота нарабатывается практически во всех типах клеток сердца [Champion et al., 2003; Massion et al., 2003], однако в нервных клетках, влияющих на работу органа в целом, роль NOS представляется особенно важной в качестве мишени потенциального терапевтического воздействия. Недавние исследования как на культурах клеток, так и in vivo, подтверждают, что основной вклад NO-ергического влияния на сердце происходит через внутрисердечные нервные структуры. Показано, что культивирование кардиомиоцитов совместно с нервными клетками увеличивает реактивность их сократимости к внесению доноров NO [Horackova et al., 1995, 1996]. На органном уровне изменения ЧСС под действием ингибиторов NOS происходят в основном за счет модуляции выделения нейротрансмиттеров из симпатических и парасимпатических окончаний [Choate et al., 2001; Herring, Paterson, 2001; Herring et al., 2002; Mohan et al., 2000, 2004; Schwarz et al., 1995].

Отметим также, что влияние нитратсодержащих препаратов на деятельность сердца также связано с их воздействием на регуляторные каскады NO в нервных клетках [Мазур, 2003; Чазов, 2004].
Цель и задачи работы:

Целью настоящей работы является выявление синтазы оксида азота в нервных ганглиях сердца человека, изучение ее содержания и распределения в этих структурах в норме и при ишемической болезни сердца.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Выявить наличие NOS гистохимическим методом в ганглиях сердца человека и кошки, описать ее распределение и архитектонику NOS-содержащих нейронов.

2. Оценить размеры популяции NOS-содержащих нейронов в сердце человека в норме.

3. Иммуногистохимическим методом определить наличие NOS1 во внутрисердечных ганглиях человека.

4. Разработать количественный подход оценки активности NOS во внутрисердечных ганглиях.

5. Описать распределение синтазы оксида азота и количественно оценить ее содержание в ганглиях сердца человека в норме и при ИБС.
Научная новизна и теоретическое значение работы:

В работе впервые показано наличие NO-синтазы в нервных клетках сердца человека. Впервые описано распределение фермента в пре- и постганглионарном звене парасимпатического отдела вегетативной нервной системы. Описано также влияние ИБС на экспрессию NOS во внутрисердечных ганглиях. Согласно полученным данным, доля NOS-содержащих нейронов в сердце у человека превышает таковую у исследованных экспериментальных животных. Практическая значимость работы связана с потенциальным использованием нервных сплетений сердца в качестве мишени фармакологического воздействия с целью модуляции деятельности этого органа. Межвидовые различия и отсутствие NO-синтазы в преганглионарном звене у крысы являются важным субстратом для экспериментального тестирования фармакологических препаратов. Кроме того, разработан подход для селективной локализации нервных ганглиев в сердце человека, что позволяет уменьшить расход реактивов для гисто- и иммуногистохимических процедур.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Во внутрисердечных ганглиях человека и кошки экспрессируется синтаза оксида азота.

2. Во внутрисердечных нейронах у человека NOS солокализована с ацетилхолинэстеразой (АХЭ).

3. При ишемической болезни сердца у человека, если не происходит дистрофических процессов, приводящих к поражению нервных клеток, во внутрисердечных ганглиях усиливается экспрессия NOS.
Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 34 рисунками, содержит 6 таблиц и 7 диаграмм. Диссертация изложена на 103 страницах, список литературы включает 191 источник.
Апробация работы и публикации.

Материалы работы доложены на всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы» 22-24 октября 2003 года (Москва), V Общероссийском съезде анатомов гистологов и эмбриологов 17-18 сентября 2004 г. (Казань), VII конгрессе международной ассоциации морфологов 16-18 сентября 2004 г. (Казань), IV Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар), конференции «Достижения и трудности современной кардиологии» 18-19 мая 2005 г. (Москва), Всероссийской конференции молодых ученых-кардиологов «Достижения отечественной кардиологии» 1-2 июня 2005 г. (Москва), 1-ом Международном междисциплинарном конгрессе «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии» 10-21 июня 2005 года (Судак, Крым, Украина).
Публикации:

По тематике диссертации опубликовано две статьи в центральных рецензируемых журналах, одна статья в сборнике и 9 тезисов докладов.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения об иннервации сердца человека и экспериментальных животных

1.1.1. Архитектоника иннервации сердца


Сердце млекопитающих иннервируется как афферентными нервными элементами, так и вегетативным отделом нервной системы – ветвями симпатического отдела и парасимпатическими волокнами в составе блуждающего нерва.

Согласно данным литературы, афферентные нервные элементы происходят из g. Nodosum и g. Jugulare и оканчиваются рецепторами различных типов на миоцитах и соединительнотканных элементах сердца [Швалев и др., 1992].

Эфферентное звено в сердце представлено как симпатическим, так и парасимпатическим отделами вегетативной нервной системы.

У человека от пограничных симпатических стволов отходят три пары симпатических сердечных нервов: верхний, или поверхностный, сердечный нерв, начинающийся двумя-тремя корешками от верхнего симпатического узла; средний, или большой, сердечный нерв, образующийся несколькими корешками от среднего шейного симпатического ганглия, в случае его отсутствия – непосредственно от шейного отдела пограничного ствола, и, наконец, нижний, или малый, сердечный нерв – от нижнего шейного или звездчатого узла, причем часто один из корешков происходит от ganglion intermedium. Верхний и средний сердечные нервы нередко соединяются вместе, прежде чем достигнуть сердечных сплетений. Кроме того, часто есть симпатические нервы, иннервирующие сердце, берущие начало от пограничного симпатического ствола ниже звездчатого узла. Эти нервы идут к сердечным сплетениям от II – VI грудных ганглиев, анастомозируют друг с другом и часто с ветвями звездчатого узла и блуждающего, и возвратного нервов. Сердечные нервы анатомически сильно варьируют в отношении как числа и объема, так и места их отхождения [Жаботинский, 1953].

От блуждающих нервов сердце получает верхние и нижние сердечные ветви. Верхние сердечные ветви обычно начинаются двумя-тремя стволиками от шейного отдела блуждающих нервов, а нижние ветви – от их грудного отдела, а также от возвратных нервов.

Со стороны симпатической системы в сердце, по-видимому, поступают только постганглионарные волокна нейронов ганглиев симпатического ствола [Швалев и др., 1992]. Вопрос об отсутствии симпатических нейронов в сердце, как таковых, следует считать решенным [Жаботинский, 1953; Швалев и др., 1992; Richardson et al., 2003]. В интрамуральных ганглиях сердца присутствуют так называемые МИФ-клетки, экспрессирующие тирозингидроксилазу и выявляющиеся люминесцентными методами определения катехоламинов [Сосунов, 1980; Randall et al., 1995; Richardson et al., 2003]. МИФ-клетки были выявлены в сердце черепахи [Chiba, Yamauchi, 1973], кролика [Papka, 1974], крысы [Zypen van der et al., 1974], морской свинки [Ellison, Hibbs, 1974], плода человека [Dail, Palmer, 1973]. МИФ-клетки могут находиться как в составе сердечных ганглиев, так и вне последних, окруженные сетью капилляров. Обычно они располагаются компактными группами-кластерами по 5-10 клеток. Форма их тела в сердечных ганглиях чаще овальная, а МИФ-клетки, лежащие вне ганглиев, несколько уплощены [Zypen van der et al., 1974]. МИФ-клетки приблизительно в 2 раза меньше средних по размерам нейронов – их диаметр 10-20 мкм.

Адренергические волокна иннервируют и предсердия, и желудочки, как проводящую систему, так и рабочий миокард. Кроме того, большое количество симпатических нервов находится в стенке коронарных сосудов.

В составе блуждающих нервов в сердце входят преганглионарные парасимпатические волокна, образующие терминали в виде перицеллюлярных аппаратов на большинстве внутрисердечных нейронов [Крохина, 1973; Швалев и др., 1992; Richardson et al., 2003].

Кроме того, в составе блуждающих нервов идет основная часть афферентных волокон, иннервирующих сердце.

1.1.2. Топография и характеристика внутрисердечных холинергических ганглиев


Таким образом, считается установленным, что большинство внутрисердечных нейронов является холинергическими, за исключением МИФ-клеток, которые относят к паранейронам.

Следует особо подчеркнуть, что в Казанской нейрогистологической школе существенное значение придавалось изучению местных рефлекторных дуг. Как известно, А.С. Догель [Dogiel, 1899] выделил среди внутриорганных нейронов три типа, среди которых клетки 1 типа являлись моторными, 2-го чувствительными и 3-го, предположительно, – вставочными. В школе Н.Г. Колосова были представлены убедительные картины наличия местных рефлекторных связей в сердце и афферентных нейронов в его ганглиях [Колосов, Хабарова, 1978]. При изучении связей нейронов в различных отделах сердца, Т.Ф. Кулешовой [1975] сделаны снимки препаратов местных рефлекторных дуг (связей клеток Догеля 1-го и 2-го типов) в сердце человека.

Топография внутрисердечных ганглиев у человека изучается с начала XX века. В.П. Воробьевым [1917] были выделены 6 сплетений с полями сосредоточения вегетативных ганглиев на поверхности предсердий. В последние годы были проведены детальные исследования топографии


Рис. 1.1. Топография нервных ганглиев сердца человека. Вид сердца сзади (А) и сверху (Б) [по Armour et al., 1997]. Обозначения: ВПВ – верхняя полая вена, НПВ–нижняя полая вена, ЛЖ–левый желудочек, ПЖ–правый желудочек.


внутрисердечных ганглиев у человека [Armour et al., 1997; Singh et al., 1996] и некоторых животных [Cheng et al., 1997, 1999; Johnson et al., 2004; Pardini et al., 1987; Richardson et al., 2003]. Было выяснено, что у человека интрамуральные нервные ганглии главным образов локализованы в эпикарде предсердий, но распространяются также на эпикард базальной части желудочков (рис. 1.1). Интересны оценки размеров ганглионарного аппарата сердца человека. По данным Armour et al. [1997], в сердце человека содержится около 14 000 нейронов, которые собраны в более чем 500 ганглиев. В этих ганглиях в среднем содержится от нескольких до порядка 200 нервных клеток.

По данным Richardson et al. [2003] у крысы внутрисердечные ганглии расположены в базальной части сердца и окружают вход в него основных кровеносных сосудов. Описана локализация внутрисердечных ганглиев как на гистологических срезах [Pardini et al., 1987], так и на тотальных препаратах [Cheng et al., 1997, 1999] сердца крысы. Нервные сплетения, окружающие легочные вены, включают три или четыре крупных ганглия, наряду с некоторым количеством более мелких, связанных между собой нервными стволиками. Хотя такая локализация соответствует данным, полученным [Cheng et al. 1999], в настоящее время считается, что эти ганглии скорее части единого сплетения, чем самостоятельные образования [Richardson et al., 2003]. Таким образом, анатомически внутрисердечные ганглии крысы – части единого сплетения, а связь между ними может обеспечиваться через систему объединяющих их нервных волокон. Внутрисердечные ганглии крыс достаточно велики и могут включать до нескольких сотен нейронов. Число нервных клеток в сердце крысы, расположенных выше атриовентрикулярной борозды, оценивалось в 4000; было выяснено, что они организованы в четыре основных группы [Pardini et al., 1987]. Эти показатели у крыс сильно отличаются от других мелких млекопитающих. Например, у морской свинки количество нейронов в сердце оценивается в 1500, большинство из которых организованы в ганглии, содержащие меньше чем по 20 клеток [Leger et al., 1999]. Следовательно, даже среди мелких млекопитающих существуют значительные различия в микроанатомии сердечных ганглиев и, соответственно, нервных сплетений частью которых они являются.

Ганглиозный аппарат сердца кошки развит относительно слабее, чем у человека и крысы [Johnson et al., 2004]. Нервные ганглии мелкие и локализованы в жировой ткани эпикарда, однако могут распространятся на межпредсердную и межжелудочковую перегородки (рис. 1.2).



Рис. 1.2. Распределение нервных ганглиев в сердце кошки [по Johnson et al., 2004]. * – места локализации внутрисердечных ганглиев, L.1–L.8 – плоскости сечения сердца на разных уровнях, svc – верхняя полая вена, ivc – нижняя полая вена, rv – правый желудочек, lv – левый желудочек, aa – дуга аорты, paa – легочная артерия.
  1   2   3   4   5