Главная страница

Цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и их чувствительность к некоторым вирусам 03. 00. 23 биотехнология


Скачать 488,68 Kb.
НазваниеЦитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и их чувствительность к некоторым вирусам 03. 00. 23 биотехнология
страница1/4
Завьялова Елена Александровна
Дата02.12.2016
Размер488,68 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2   3   4




На правах рукописи


Завьялова Елена Александровна


Цитоморфологическая характеристика

культур клеток рыб и их чувствительность

к некоторым вирусам
03.00.23 – биотехнология


АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2006
Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

(ВИЭВ им.Я.Р.Коваленко)

Научные руководители:

Кандидат ветеринарных наук, в.н.с.

Пичугина Татьяна Дмитриевна
Заслуженный деятель науки РФ,

Доктор биологических наук, профессор

Дьяконов Лев Петрович

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук

Жидков Станислав Александрович

(ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко)
Кандидат биологических наук, доцент

Кондратьева Ирина Анатольевна

(Международный биотехнологический центр

МГУ им. М.В.Ломоносова)

Ведущая организация – Московская государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита диссертации состоится « » 2006 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект 24, к.1, ВИЭВ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ

Автореферат разослан « »__________________ 2006 г.
Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Н.П.Овдиенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Метод культивирования клеток вне организма является большим достижением биологической науки, так как позволяет получать наиболее объективные и надежные данные при диагностике вирусных инфекций, использовать их в биотехнологических процессах при производстве вакцин, для получения интерферона, а также при синтезе моноклональных антител. (Wolf K. et.al., 1980; Sasson A., 1987; Животная клетка в культуре, 2000).

Культуры клеток рыб также являются объектом биотехнологии и вирусологии. Наибольшую потенцию роста in vitro имеют клетки гонад неполовозрелых рыб и их эмбрионы (Dannevig B.H. et.al., 1997), культуры, приготовленные из зрелых тканей, обладают слабой потенцией роста (Miller N.W. et.al., 1994a; Rode M. et. al., 1997; Wergeland H.I. et.al., 2001). В некоторых случаях перевиваемые культуры клеток получены из новообразований: саркомы, лимфосаркомы, гепатомы, нефробластомы и оспенной эпителиомы (Soustegard R.A. & Soustegard K.S., 1973; Fijan N., Sulimanovic D. et. al., 1983).

Благодаря получению однослойных культур клеток гонад карпа в нашей стране впервые в 1970 году был выделен вирус от больных карпов, а при изучении свойств и роли вируса в патологии рыб установили, что этот агент вызывает заболевание названное весенняя вирусная болезнь карпа (Рудиков Н.И., 1986). В 2001 году впервые в России от мальков семги, полученных из оплодотворенной икры, завезенной из Норвегии, в культуре клеток сердца кеты был выделен вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых, представитель семейства Birnaviridae (Пичугина Т.Д. с соавт., 2005а).

Таким образом, с возникновением острых вирусных эпизоотий среди карповых и лососевых рыб, появилась необходимость в совершенствовании методов диагностики, основанных на использовании как первичных, так и перевиваемых культур клеток.

В практической вирусологической работе наиболее важным является изучение спектра чувствительности культур клеток к различным вирусам (Kelly R.K. et.al., 1978; Kielian M. et.al., 1990). Не все линии клеток изучены достаточно полно в этом отношении. Так, в культуре клеток FHM реплицируются, по крайней мере, четыре вируса рыб - IPNV, SVCV, VHSV, IHN и два вируса теплокровных животных (Gravell M. et.al., 1965). Культура клеток CHSE – 214, из эмбрионов чавычи, чувствительна к вирусам герпеса лососевых, IHN, IPN и VHS (Kibenge F.S.B. et.al., 2000). Культура клеток из оспенных поражений карпа ЕРС также имеет широкий спектр чувствительности и в ней реплицируются вирусы SVC, VНS, а также вирусы европейского угря. Особый интерес представляет линия клеток радужной форели RTG–2, чувствительная к шести вирусам рыб, а также к вирусам венесуэльского и восточного энцефаломиелитов лошадей, и отека головастиков (Hjalmarsson A. et.al., 1999).

Однако, несмотря на существование большого количества перевиваемых клеточных линий рыб не все из них могут быть использованы в диагностике. Для областных и районных диагностических лабораторий зачастую не представляется возможным и экономически оправданным приобретение из-за рубежа или исследовательских институтов необходимых линий клеток. Более того, работа с зарубежными культурами клеток рыб сопряжена с определенными трудностями при культивировании. В качестве альтернативы при диагностических исследованиях для выделения и накопления вируса возможно использование первичных культур и субкультур клеток, полученных из тканей восприимчивых к данному вирусу рыб (Office International des Epizooties, 2000).

Таким образом, расширение исследований по получению первичных культур клеток и субкультур, чувствительных к определенным вирусам рыб, и создание в дальнейшем отечественных постоянных линий является актуальной научной проблемой.

Цель работы: изучить культурально-морфологические свойства первичных культур клеток, субкультур и клеток перевиваемых линий из тканей различных видов рыб и определить чувствительность к вирусам-возбудителям инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC).

Основные задачи исследований:

  • Получить первичные культуры и субкультуры клеток из тканей внутренних органов и гонад лососевых, карповых и аквариумных рыб и дать цитоморфологическую характеристику.

  • Изучить чувствительность культур клеток из тканей лососевых рыб к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы (IPN) лососевых и культур клеток из гонад карася к вирусу весенней виремии карпов (SVC).

  • Определить чувствительность и возможность адаптации культуры клеток из эмбрионов аквариумных рыб к вирусам рыб, разводимых в аквакультуре.

  • Изучить морфологические изменения в клетках перевиваемых линий СНН-1 и CHSE-214, инфицированных полевым и референтным штаммами вируса IPN.

  • Разработать схему преодоления непермиссивности клеток перевиваемой линии эпителиальной папилломы карпа (ЕРС) к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN).

  • Изучить в сравнительном аспекте цитопатогенное действие полевого штамма ВС-1, референтных штаммов вируса IPN и SVC на перевиваемые культуры клеток сердца кеты СНН-1 и эпителиальной папилломы карпа ЕРС.

Научная новизна

Получены субкультуры клеток из первичных культур клеток гонад радужной форели и серебряного карася, дана их цитоморфологическая характеристика и определена чувствительность к вирусам инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC) соответственно.

Получена и адаптирована для размножения вируса весенней виремии карпов (SVC) субкультура из клеток эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи.

Отработана схема перевода непермиссивных клеток эпителиальной паппиломы карпа в состояние пермиссивности по отношению к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN).

Практическая ценность работы заключается в том, что в результате проведенных исследований отработаны методы получения первичных культур и субкультур из внутренних органов и гонад радужной форели, гонад карася и эмбрионов гуппи, чувствительных к вирусам лососевых и карповых рыб и показана возможность использования их в вирусологических исследованиях.

Апробация

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

Заседании научно-консультативного Совета по болезням рыб Межведомственной Ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2003г.); Конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (ВИЭВ, 2003г.); Second Bilateral Conference «Aquatic & marine animal health» (USA, 2003); Совещании, посвященном научно-практическим проблемам инфекционной патологии и охраны здоровья рыб, (ВИЭВ, 2004г.); Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов». (Санкт-Петербург, 2004г.); Конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (ВИЭВ, 2005г.); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005г.); Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2006г.)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 131 страницах и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 25 рисунками. Список литературы включает 178 публикаций, в том числе 147 иностранных.

Собственные исследования

Работа выполнена в 2002 - 2006 гг. в лаборатории ихтиопатологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко в рамках задания 02.01.18 РНТП «Изучить эпизоотическое состояние рыбоводческих хозяйств по вирусным и бактериальным инфекциям, взаимодействие инфекционных агентов с различными видами тканевых культур».

1. Материалы и методы

1.1. Рыбы. В опытах по приготовлению первично-трипсинизированных культур клеток было вскрыто 16 экземпляров радужной форели (Salmo irideus Gibbons) средней штучной массой 500 г, 44 экземпляра серебряного карася (Carassius carassius L.) средней штучной массой 200 г и 27 экз. самок аквариумной рыбы-гуппи (Lebistes reticulates L.) средней массой – 2,5-3г.

Работу проводили согласно методам, изложенным в руководстве «Животная клетка в культуре», 2000.

1.2. Культуры клеток. В работе с культурами использовали стандартные питательные среды и растворы: ИГЛА МЕМ, ИГЛА МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов, 0,02% раствор версена (ЭДТА), 0,25% раствор трипсина, фетальная телячья сыворотка, раствор Хенкса, антибиотики (гентамицин, канамицин, пенициллин, ампиокс и т.п.), 0,05% раствор трипанового синего, 0,1% раствор кристаллвиолета, метиловый спирт или этиловый абсолютный, уксусная кислота, готовый краситель по Романовскому-Гимза, ксилол, бальзам кедровый.

Для изучения морфологических изменений в культурах клеток использовали зарубежные перевиваемые линии клеток, любезно предоставленные с.н.с. лаборатории ихтиопатологии ВНИИПРХ Щелкуновым И.С.: CHSE–214 (Нормальный эмбрион чавычи, Oncorhynchus tshawytscha Walbaum), CHH-1 (Сердце кеты, Onchorynchus keta Walbaum), ЕРС – (Эпителиальная папиллома карпа, Cyprinus carpio L.). Культуры клеток поддерживали путем периодического пассирования. Пересев осуществляли по мере формирования монослоя бесцентрифужным методом смесью 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1 (CHH-1), 1:2 (CHSE – 214), коэффициент пересева 1:2 – 1:3, температура инкубации 15-16оС. Монослой культуры ЕРС снимали с поверхности роста 0,02% раствором версена, коэффициент пересева 1:2 – 1:5, температура инкубации 22-23оС.

Цитологические методы исследований. Для приготовления цитологических препаратов клетки выращивали на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах. Объем суспензии 1,5-2,0 мл. Клетки фиксировали смесью этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (3:1) или абсолютным этиловым спиртом, и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе.

1.3. Вирусы. Вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPNV) европейский референтный штамм был любезно предоставлен д-ром Erke Neuvonen, (НИИ ветеринарии и продовольствия Хельсинки).

Полевой штамм вируса инфекционного некроза поджелудочной железы, выделенный сотрудниками лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко в 2001 году от мальков семги в одном из рыбоводческих хозяйств Мурманской области, названный ВС-1. (Pichugina T.D. et al., 2003; Пичугина Т.Д. с соавт., 2005a).

Вирус весенней виремии карпа (SVCV), отечественный референтный штамм «ЗЛ4», изолированный в 1991 году от годовиков карпа в рыбоводческом хозяйстве «Заветы Ленина», Краснодарского края, был любезно предоставлен И.С.Щелкуновым, (ВНИИПРХ).

Титрование вирусов. Готовили 10-кратные разведения вируса на питательной среде (Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов без сыворотки). Учет цитопатогенного действия проводили микроскопированием зараженных культур, начиная с 5 часов после инокуляции и до 5-7 дней включительно. Титр вирусов определяли по методу статистического учета Reed L.J., Muench H. A. (1938) и выражали в тканевых цитопатогенных дозах в 1 мл (ТЦД50/мл).

Результаты исследований обрабатывали методом математической статистики (Лакин Г.Ф. 1990).
2.Результаты исследований

2.1. Разработка методов получения первичных и субкультур клеток из тканей лососевых рыб (Salmo irideus Gibbons) и их цитоморфологическая характеристика

Одной из задач наших исследований было разработать оптимальные методы дезагрегации ткани с выходом большего количества клеток для выращивания первичных культур и их субкультивирования. В исследованиях по получению первично-трипсинизированных культур клеток из внутренних органов форели установлено, что для каждого органа предпочтителен определенный режим дезагрегации, позволяющий получить наибольшее количество жизнеспособных клеток.
2.1.1. Культура клеток из ткани сердца радужной форели.

Поставлено 4 опыта. В экспериментах использовали трипсин рН 7,4-7,5; версен и их смесь. В первом варианте измельчённые ткани заливали 0,25% раствором трипсина, во втором - 0,02% раствором версена, в третьем варианте смесью 0,02 %-ного раствора версена и 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 1:1, в четвертом - в соотношении 2:5.

Результаты опытов по дезагрегации ткани сердца форели представлены в таблице 1.


Таблица 1. Выход клеток при дезагрегации ткани сердца форели (n=4)

Диспергирующий раствор

Время дезагрегации

Вариант 1

Вариант 2

Вариант 3

Вариант 4

Трипсин 0,25% р-р

Версен

0,02% р-р

версен 0,02 % + трипсин 0,25 %

1:1

версен 0,02 % + трипсин 0,25 %

2:5

Всего

тыс.кл/мл

Жизне-

способн.

%

Всего

тыс.кл/мл

Жизне-

способн. %

Всего

тыс.кл/мл

Жизне-

способн. %

Всего

тыс.кл/мл

Жизне-

способн. %

30 мин.

120,4

32,4

62,1

56,7

78,2

43,3

83,9

46,8

60 мин.

260,8

48,0

86,4

70,3

106,6

89,5

125,4

85,6

90 мин.

340,8

42,8

103,5

68,4

170,3

79,1

206,2

82,2

120 мин

400,2

36,4

132,6

63,1

206,6

76,6

286,4

74,2

150 мин.

420,3

22,3

176,6

51,4

260,1

69,9

317,0

65,1


Из таблицы видно, что применение 0,25% раствора трипсина сильно травмирует клетки, жизнеспособность очень низкая (32,3 – 22,3%). Применение 0,02% раствора версена дает небольшой выход клеток с низкой жизнеспособностью, возможно из-за длительности дезагрегации. Дезагрегация по третьему и четвертому варианту давала сопоставимые значения жизнеспособности (69,9% и 65,1%), но использование смеси версен+трипсин как 2:5 позволило получить больший выход клеток 317,0 тыс.кл/мл. Оптимальные результаты получены при дезагрегации ткани пятью циклами по 30 минут с использованием смеси 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 2:5.

Для культивирования использовали среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов с 10% фетальной телячьей сыворотки и L-глютамином (300 мг/мл). Посевная концентрация около 600 тыс. клеток в 1 мл среды.

Анализ цитологических препаратов показал, что клетки сердца форели (СФ) образуют монослой в течение 3-4 месяцев (рис.1). Клетки в основном эпителиоподобного типа, полигональной формы. В ядрах содержится 1-3 ядрышка.


2.1.2. Культура клеток из ткани почек радужной форели.

Поставлено 4 опыта. В экспериментах использовали такие же варианты диспергирующих растворов, как и для ткани сердца радужной форели. Ткани заливали рабочими растворами и экстрагировали на магнитной мешалке в течение 40 мин до истощения тканей головной и туловищной почки. Определяли концентрацию и жизнеспособность клеток.

В результате проведенных исследований было установлено, что при дезагрегации в течение 40 минут и использовании различных диспергирующих растворов, наилучший результат удалось получить при использовании 0,25% раствора трипсина. Ткани полностью дезагрегировались, был получен наибольший выход 760,4 тыс.кл/мл с высокой жизнеспособностью (70,3%).

Монослой из клеток почки форели (ПРФ) неоднородный, рыхлый, с напластованиями (рис 2). Ядра мелкие, с 1-3 ядрышками, оттеснены к периферии клетки, цитоплазма вакуолизирована. Клетки дают быстрый встречный рост и сливаются в течение 10-15 дней, однако очень нестабильны, и в возрасте примерно 20 дней монослой начинает спонтанно дегенерировать.


2.1.3. Культура клеток из ткани селезенки радужной форели

В литературе (H.I. Wergeland, R.A. Jakobsen, 2001) имеются данные о том, что использование раствора трипсина (0,25%) для дезагрегации клеток селезенки рыб приводит к потере адгезивной способности. Поэтому в следующей серии опытов по дезагрегации органов форели использовали 0,02% раствор версена – вариант 1, во втором и третьем варианте в соотношении 1:1 со средой Игла МЕМ и 0,25% раствором трипсина, соответственно.

Использование раствора, состоящего из смеси 0,02% версена и 0,25% трипсина давало большой выход клеток, но жизнеспособность была очень низкая, при культивировании сплошной монослой получить не удавалось. Применение 0,02% раствора версена или его смеси со средой Игла МЕМ приводило к получению меньшего числа клеток (800,1 и 732,9), их жизнеспособность составляла 70,1 и 66,1 соответственно.

Клеточные суспензии с концентрацией 500 тыс.кл. в 1 мл культуральной среды высевали в культуральные флаконы и лунки микропланшетки и оставляли при температуре 15 и 18оС. Каждые три дня инкубации флаконы просматривали. Через 7 дней заменяли треть ростовой среды, в дальнейшем среду заменяли на 1/3 каждые две недели, через два месяца среду заменяли полностью.

Во всех флаконах наблюдали большое количество эпителиоподобных прикрепившихся клеток, наиболее активный рост вокруг эксплантированных кусочков ткани (рис 3). Первые два месяца инкубирования при температуре 15 оС рост культур клеток селезёнки форели (СЛФ) был медленным, при этом все клетки имели эпителиоподобный тип морфологии, монослой неоднородной плотности формировался через 5 месяцев.

Ядра крупные, содержат 1-2 ядрышка, в некоторых клетках имеется 2 и 3 ядра. Цитоплазма неоднородная, содержит мелкие вакуоли.

В культурах, которые инкубировали при 18оС, через два месяца наблюдали зоны активного роста, состоящие в основном из фибробластоподобных клеток, имеющих форму веретена и удлиненное ядро. Монослой формировался через три месяца
  1   2   3   4